Анализ ПЦР: что это, расшифровка результатов

В каких случаях сдается анализ?

Содержание:

анализ днк
Метод полимеразной цепной реакции на уровне ДНК применяют в самых разных медицинских областях:

  • криминалистам он помогает идентифицировать биологические материалы, например, волосяной покров, слюнную жидкость, кровь;
  • анализы ПЦР используются для выявления генотипа, например, при выявлении индивидуальной реакции на медикаментозные вещества, заложенной генетически;
  • методика помогает в установлении родственных связей;
  • но больше всего ПЦР анализ востребован в медицинском диагностировании, он помогает обнаружить разного рода генетические отклонения и инфекционные недуги.

Важный совет от редакции!

Если вы испытываете проблемы с состоянием волос, особое внимание стоит уделить шампуням, которые используете. Пугающая статистика – в 97% шампуней известных марок находятся компоненты, отравляющие наш организм. Вещества, из-за которых все беды, в составе обозначаются как содиум лаурил/лаурет сульфат, коко сульфат, ПЭГ, ДЕА, МЕА.

Эти химические компоненты разрушают структуру локонов, волосы становятся ломкими, теряют упругость и силу, цвет тускнеет. Также, эта гадость попадает в печень, сердце, легкие, накапливается в органах и может вызывать различные заболевания. Мы рекомендуем отказаться от использования средств, в которых находится эта химия. Недавно наши эксперты провели анализов шампуней, где первое место заняли средства от компании Mulsan Сosmetic.

Единственный производитель полностью натуральной косметики. Вся продукция производятся под строгим контролем качества и систем сертификации. Рекомендуем к посещению официальный интернет-магазин mulsan.ru. Если сомневаетесь в натуральности вашей косметики, проверьте срок годности, он не должен превышать одного года хранения.

Чем ПЦР лучше других методик?

Обследование биологических материалов данным способом используется довольно часто и отличается от других диагностик, прежде всего, своей высокой точностью и легкостью сдачи.

этапы пцр-анализа

Этапы ПЦР-анализа.

К преимуществам можно отнести следующее:

  • в анализе обнаруживается инфекционный возбудитель; выявляется ДНК или РНК инфекционный агент;
  • точность результата варьируется от 99 до 100%, очень мала вероятность ложноотрицательного ответа, а ложноположительный – практически невозможен;
  • ПЦР 12 – максимально чувствительный метод, позволяющий выявлять даже единичные клетки возбудителей инфекций;
  • сдав биоматериал, забирать результат анализа ПЦР можно уже спустя 4 часа, именно столько времени нужно для его изучения;
  • методика позволяет обнаруживать возбудителей без сопутствующей симптоматики, а ранняя диагностика способствует своевременному лечению;
  • также анализ доказал свою эффективность и после того, как болезнь уже прошла.

разглядывание в микроскоп
За годы использования анализ методом ПЦР не раз усовершенствовался и обновлялся. С каждым годом появляются новые разновидности исследования полимеразной цепной реакции, дающие уникальную возможность обнаружения различных патологических состояний до их активного развития.

В самом начале появления исследования ПЦР не каждый пациент мог себе позволить подобную дорогостоящую диагностику, сегодня же ее стоимость вполне приемлема, кроме того, многие лаборатории предлагают такую услугу.

Какие инфекционные возбудители выявляются?

От данного диагностического исследования не может скрыться ни один патогенный возбудитель.

забор материала для пцр анализа
Расшифровка может показать наличие следующих инфекционных агентов:

  • пикорнавирусов (вызывающих гепатит);
  • дрожжеподобных грибов Кандида (виновников кандидоза, так называемой «молочницы»);
  • хламидий – в этом случае мазок указывает на наличие хламидиоза;
  • папилломавирусов – вызывают появление доброкачественных образований (ВПЧ);
  • вирусов, вызывающих развитие герпетической инфекции;
  • раковых клеток – раннее выявление опасного заболевания;
  • бактерий микоплазм – возбудителей микоплазмоза;
  • анаэробных бактерий – если анализ ПЦР (мазок) указал на их наличие, значит речь идет о бактериальном вагинозе;
  • бактерий, провоцирующих уреаплазмоз в мочеполовой системе;
  • ДНК геномного вируса Эпштейна, вызывающего развитие инфекционного мононуклеоза;
  • влагалищную трихомонаду, возбудителя трихомониаза;
  • вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, а в дальнейшем – развитие СПИДа).

Кроме того, рекомендуется сдавать анализ на полимеразную цепную реакцию для того, чтобы оценить гормональный фон организма.

Разновидности диагностики

достоинства пцр

Достоинства метода ПЦР.

Как уже отмечалось, в современной медицине используется несколько типов диагностики ПЦР:

  • полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией – амплификация, выделение и идентификация одного из специфических фрагментов РНК;
  • инвертированная методика – позволяет выявлять рядом находящиеся последовательности после помещения ДНК в совокупность генов;
  • ассиметричная методика – используется для создания (амплифирации) дополнительных участков хромосомных ДНК;
  • ступенчатая методика – помогает снизить воздействие неспецифического связывания олигонуклеотидов;
  • групп-специфические исследования – ПЦР для родственных последовательностей, в одном виде или среди нескольких;
  • количественный анализ ПЦР – исследование в реальном времени, позволяющее наблюдать за изменением количества определенного ПЦР компонента в каждых циклах процесса.

Забор биоматериала

Получив направление, у пациентов возникает вполне закономерный вопрос – как сдаются анализы на инфекции ПЦР?

днк и пробирки
Прежде всего, берется во внимание, для каких целей проводится исследование:

  1. Выявление половых инфекционных заболеваний. В этом случае берется мазок со слизистой влагалища, цервикального или мочеиспускательного канала, а также сдается моча. Женщинам рекомендовано сдавать анализ перед менструацией или после нее.
    Анализ ПЦР на хламидии является самым точным способом выявления этих возбудителей, так как не все исследования способны их обнаруживать, а само заболевание хламидиоз нередко протекает бессимптомно.
    Существует несколько правил, как сдать подобный анализ и получить достоверный результат:
    1. не ходить в туалет «по-маленькому» минимум 3 часа до процедуры;
    2. не пользоваться антибактериальными, дезинфицирующими средствами;
    3. отказаться от полового контакта за 2 суток до сдачи анализа;
    4. перед тем, как сдавать мазок, женщинам не стоит спринцеваться, пользоваться суппозиториями для вагинального введения;
    5. также не следует сдавать анализ во время менструального кровотечения.
  2. Интерпретация результата может исказиться, если сдавать биоматериал во время приема антибиотиков или уросептиков.
  3. Диагностирование инфекционного мононуклеоза. Для исследования сдается слюна, кровь и сывороточная ее часть.
  4. Анализ ПЦР на гепатит С, ВИЧ и другие инфекции. Сдается кровь, сыворотка и плазма, причем используется вакуумная система, поэтому метод минимально травматичен и полученный биоматериал практически изолирован от воздействия окружающей среды.
    Анализ крови ПЦР сдается на голодный желудок, также нельзя перед сдачей пить. Кроме того, за месяц до процедуры стоит отказаться от приема уросептиков и антибиотиков.
  5. Анализ ПЦР на туберкулез. Выявляется уровень туберкулезных микробактерий (палочек Коха) в мокроте. Этот же материал сдается для выявления микоплазмоза и хламидиоза в респираторной форме. Мокроту собирают в стерильную емкостью.

Зачем сдавать анализ во время беременности?

девушка с пробирками
Будущая мамочка должна сдать анализы уже при постановке на учет, в том числе и полимеразную цепную реакцию. Подобное лабораторное исследование позволяет выявлять опасные недуги до того, как они наносят непоправимый вред здоровью женщины и будущего малыша.

Может происходить забор следующих биоматериалов:

  • мазок со стенок цервикального канала;
  • крови, сыворотки;
  • околоплодной жидкости или частиц хориона (назначается при определенных показаниях).

Своевременный анализ мазка и других материалов помогут избежать возможных осложнений.

Что такое геном?

Известно, что каждое живое существо на планете обладает определенным набором наследственной информации, которая передается от поколения к поколению. У человека это информация зашифрована в 46 хромосомах, у других живых существ, как животных, так и растений, существует иное количество хромосом. Но в каждой хромосоме содержатся очень компактно скрученные нити ДНК – дезоксирибонуклеиновой кислоты, которая является гигантской молекулой «биологической памяти».

Именно молекула ДНК хранит закодированную информацию о структуре живой ткани, а точнее — о белках, которые должны синтезироваться. По сути, ДНК представляет собой матрицу, на которой один за другим располагаются участки, отвечающие за синтез отдельных белков. У каждого живого существа есть свои собственные, уникальные участки этой молекулы, которые не встречаются у другого вида: белки строго видоспецифичны, а их определенная последовательность также уникальна. Как же можно воспользоваться этой структурой в диагностических целях?

В том случае, если проводится анализ крови ПЦР методом, то можно выделить наследственный материал тех живых существ, которые оставили свои следы в организме человека. Конечно, прежде всего, это возбудители различных инфекционных заболеваний: вирусы и бактерии, грибы и простейшие, другие патогенные формы жизни.

Вся сложность состоит в том, что если в организм человека попало определённое количество возбудителей, например, бактерий, и организм их уже успела разрушить, то в плазме крови сохраняются незначительные обрывки наследственной информации.

Эти обрывки и остатки содержат, в том числе, фрагменты тех самых уникальных последовательностей ДНК, но их нужно каким-то образом сделать узнаваемыми. Как же получить выявляемые участки генома, которые можно подвергнуть дальнейшему исследованию, и дать ответ, находится ли данный возбудитель в организме, или его остатки? Для этого и разработан метод полимеразной цепной реакции, или анализ крови на ПЦР в медицине. В чём суть метода?

Что такое полимеразная реакция?

Полимераза — это особый фермент, который в соответствующих условиях может многократно умножать, или амплифицировать заданный участок ДНК, копируя его много раз. Этот метод напоминает человека, который вошел в темную комнату с зеркальными стенами, и зажег в ней фонарик. Многократное отражение луча от стен делает комнату светлой, хотя луч из фонарика по-прежнему выходит один. Также и фермент ДНК полимераза, позволяет многократно увеличить количество наследственного материала, делая его концентрацию доступной для определения.

Анализ ПЦР: что это, расшифровка результатов
Сама технология этой реакции — достаточно тонкий процесс. В начале необходимо задать точную температуру, которая измеряется десятыми долями градусов. Материал, в котором, возможно, находится наследственный материал возбудителей, нагревают до высокой температуры, чтобы разрушить водородные связи внутри двухцепочечной структуры ДНК.

Затем добавляется в раствор ДНК полимераза, особые праймеры, которые крепятся к свободным концам фрагментов ДНК, откуда и начинает работать полимераза, туда же добавляются нуклеотиды — аденин, гуанин, цитозин и тимин, и проводятся определенный технологические процедуры. В результате на выходе образуется гораздо больше копий с заданными параметрами, чем на входе этой реакции. Если ДНК полимераза успешно справилась с заданием, то многократно умноженный и достроенный фрагмент сверяется с необходимой базой данных, и затем делается заключение о наличие в организме определённого возбудителя.

Читайте также:  Как избежать укусов клещей этим летом – 10 элементарных правил

Где еще применяется ПЦР?

Анализ ПЦР: что это, расшифровка результатов

Не стоит думать, что анализ крови на ПЦР и применение ее в медицине является единственным. Различных способов исследовать наследственный материал методом ПЦР существует много. Насчитывается более 10 разновидностей полимеразной цепной реакции, например, инвертированная, ступенчатая, с обратной транскрипцией, ПЦР длинных фрагментов, и даже виртуальная ПЦР. Последняя разновидность есть не что иное, как математический метод компьютерного моделирования, который проводится для предсказания достоверности будущих реакций.

В современной практике полимеразная цепная реакция с успехом применяется в криминалистике, если на месте преступления оставлены биологические материалы. Если есть подозреваемый, то нет никаких проблем с идентификацией принадлежности материала конкретному лицу.

ПЦР диагностика помогает выявить отцовство, а также применяется для клонирования генов, которая необходима в современной медицине для создания моноклональных антител. Они перспективны как способ лечения лечения злокачественных новообразований, рассеянного склероза, и многих аутоиммунных болезней. Также это реакция применяется в генетике для секвенирования ДНК, а также для экспериментального мутагенеза, или внесения необходимых исследователям изменений в избранный геном.

Применение в медицине

Анализ ПЦР: что это, расшифровка результатов

Расшифровка анализа крови, выполненного методом ПЦР, позволяет быстро и с высокой достоверностью определить наличие в организме пациента возбудителей очень многих заболеваний, которые не растут на искуственных средах. Чаще всего к ним относятся различные вирусы и «капризные» микроорганизмы. Это вирусы папилломы и клещевого энцефалита, цитомегаловирусная инфекция и туберкулез, вирусные гепатиты и мононуклеоз, герпетическая инфекция и ВИЧ-инфекция,  микоплазменная и хламидийная инфекция.

Что показывает анализ? Практически всегда он выполняется качественно, и в заключении дается ответ, есть в образце наследственный материал определенного возбудителя, или его нет, человек заражен, или инфицирования не выявлено. Иногда проводится количественное определение, но оно выполняется реже и стоит дорого дороже.

Большим преимуществом является то, что сдавать кровь на ПЦР вполне можно безо всякой подготовки, в отличие от изучения многих биохимических показателей. Кровь сдается, как обычно, без сложностей. В начале XXI века метод ПЦР — золотой стандарт диагностики различных инфекций. Но, как и у любого способа, у метода ПЦР имеются плюсы и минусы.

Что такое ПЦР анализ

Анализ ПЦР относится к молекулярному методу диагностики, который основан на многократном увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) возбудителя в любом биологическом материале (мазке из шейки матки, влагалища, уретры, крови, слюны, мокроте и т. д.) и сопоставление его ДНК или РНК с базой данных известных видов возбудителей инфекций.

Методика разработана американцем Кэрри Мюллисом в 80-х годах прошлого столетия. В 1993 ученый стал лауреатом Нобелевской премией в области химии. Сегодня исследование ПЦР считается своего рода «золотым стандартом» для диагностирования подавляющего большинства инфекций. Анализ ПЦР повсеместно применяется в медицинской практике для уточнения характера болезни и постановки точного диагноза. Очень часто бывают случаи, когда все известные иммунологические, вирусологические и бактериологические методы не действуют. Тогда ПЦР становится единственным способом, с помощью которого можно выявить активную стадию заболевания.

Что такое ПЦР анализ

Преимущества ПЦР-диагностики над другими методами

Методика ПЦР нашла широкое применение в современной медицине благодаря ряду бесспорных преимуществ. Расскажем о них более подробно.

Возможность прямого выявления присутствия возбудителя

Многие из традиционных диагностических методик основаны на определении маркеров – белков, которые являются продуктами жизнедеятельности возбудителя болезни. Такой принцип диагностики может дать только опосредованное подтверждение патологии. Метод ПЦР обеспечивает прямое определение возбудителя, поскольку выявляет специфические участки ДНК патогенных организмов.

Высокая специфичность

Методика ПЦР отличается высокой специфичностью благодаря тому, что позволяет выявлять фрагменты ДНК, характерные только для конкретного инфекционного агента. При использовании иммунологических методов остается вероятность получить ложный результат (ошибки в диагностике связаны с перекрестно-реагирующими антигенами). Что касается ПЦР, то здесь ошибки исключены, поскольку специфичность в данном случае задается нуклеотидной последовательностью праймеров.

Высокая чувствительность

Посредством этого метода определяются даже единичные болезнетворные микроорганизмы. Возбудители инфекций выявляются в организме человека даже тогда, когда другие методы диагностики не проясняют ситуацию (речь идет о различных иммунологических микроскопических и бактериологических способах исследования).

Приведем данные для сравнения. Чувствительность микроскопических и иммунологических методов составляет 103-105 клеток, а чувствительность ПЦР – 10-100 клеток в пробе.

Универсальность метода

Методика ПЦР основана на исследовании ДНК патогенных организмов. В процессе исследования определяются фрагменты РНК или ДНК, которые являются специфичными для конкретных возбудителей инфекций. Поскольку все нуклеиновые кислоты имеют сходный химический состав, при лабораторном анализе можно применять унифицированные методики. А это значит, что исследование одной пробы дает возможность выявлять сразу несколько возбудителей.

Быстрое получение результатов

Данная методика не требует выращивания культур возбудителей, на которое уходит довольно много времени. Благодаря применению унифицированной технологии обработки материала и выявления продуктов реакции, а также автоматизированному процессу амплификации вся процедура исследования занимает лишь несколько часов.

Возможность выявления инфекций в латентной форме

Методика ПЦР дает возможность эффективно выполнить доклиническую диагностику (выявление возбудителей до появления симптоматики) и ретроспективную диагностику (определение патогенов после перенесенной болезни). Так, доклиническая диагностика имеет большое значение при обследовании пациента в инкубационном периоде возможного заболевания – после предполагаемого заражения до возникновения первых признаков.

Одним из важных преимуществ ПЦР является возможность использования для анализа биологических остатков или архивных материалов. Это дает возможность идентифицировать отцовство и личность.

На сегодняшний день методы ПЦР-диагностики продолжают развиваться. Усовершенствуется сама технология проведения анализа, а также появляются новые виды ПЦР. В медицинскую практику внедряются инновационные тест-системы для этой реакции. Благодаря такому быстрому развитию науки стоимость процедуры уменьшается, и теперь обследование ПЦР может применяться для многих категорий пациентов.

Суть метода ПЦР

В основе этого метода диагностики лежит многократное удвоение данного участка РНК или ДНК. Этот процесс реализуется в лаборатории с использованием особых ферментов. В итоге формируется столько участков ДНК (РНК), сколько нужно для визуального исследования. Во время процедуры копируется лишь участок, соответствующий заданным условиям (если он присутствует в изучаемом образце).

Биологический материал, которые необходимо исследовать на наличие ДНК или РНК возбудителей помещают в амплификатор. (В зависимости от конкретной ситуации для анализа берут кровь, мочу, слюну, отделяемое из половых органов). Затем к образцам добавляют особые ферменты. Они связываются с РНК или ДНК патогенных микробов, и начинается синтез копий. Копирование представляет собой многоэтапный процесс, протекающий по типу цепной реакции. В результате возможно появление сотен или даже тысяч копий.

Суть метода ПЦР

На следующем этапе диагностики результаты анализируются и сопоставляются с базой данных возбудителей инфекций.

Методика ПЦР не просто дает возможность определить вид патогенного организма, но и позволяет сделать выводы о количестве возбудителей инфекции в человеческом организме.

Сегодня применение подобных технологий открывает широкие возможности при исследовании мутаций, сращивания участков ДНК. В современной медицине метод начал применяться для определения отцовства, выявления новых генов и многого другого.

Благодаря своей универсальности метод ПЦР нашел широкое применение в урологии, гинекологии, пульмонологии, онкологии, гематологии, фтизиатрии, практике инфекциониста и других областях медицины.

Материал для анализа ПЦР

Для ПЦР диагностики применяются различные биологические среды и жидкости, взятые из организма человека: мокрота, слизь, слюна, моча, кровь, соскоб эпителиальных клеток, ткани плаценты, плевральная жидкость, околоплодная жидкость, сок простаты и др.

При диагностике ЗППП (ИППП) анализу подвергаются выделения из мужских и женских половых органов. Для этого выполняют мазок или соскоб из уретры или шейки матки. Также для исследования используют мочу.

Для выявления инфекций (герпес, мононуклеоз, ЦМВИ, токсоплазмоз, ВИЧ, гепатиты В и С) на анализ берут кровь. При подозрениях на поражения нервной системы производят забор спинномозговой жидкости.

Для пульмонологических исследований используют плевральную жидкость и мокроту.

Для выявления внутриутробных инфекций анализу подвергают ткани плаценты и околоплодную жидкость.

ПЦР на ИППП и другие инфекции

Какие инфекции можно выявить с помощью анализа ПЦР

– ВИЧ-инфекция (можно выявить вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1).

– Вирусные гепатиты А, В, С, G ( РНК-HAV, ДНК-HBV, РНК-HCV, РНК-HGV).

– ИППП (инфекции, передающиеся половым путем) – уреаплазмоз, гарднереллез, хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз.

– Инфекционный мононуклеоз (ДНК вируса Эпштейн-Барр -ВЭБ).

– Цитомегаловирусная инфекция (ДНК-CMV).

– Герпетическая инфекция (ДНК- вируса простого герпеса ВПГ 1 и 2 типа).

– Туберкулез (микобактерия туберкулеза).

– Онкогенные вирусы – папилломавирусная инфекция (вирус папилломы человека (в том числе его онкогенные виды 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58, и 59).

– Боррелиоз, клещевой энцефалит.

– Листериоз.

– Кандидоз (грибы рода Candida).

– Хеликобактерная инфекция (Helicobacter pylori)

и другие.

Подготовка и сдача анализа ПЦР

Пациенты, сдавшие материал для проведения ПЦР диагностики, рассчитывают на получение быстрого и точного результата. При этом нужно учесть один важный момент – достоверность диагностики зависит не только от профессионализма специалистов и возможностей медицинской лаборатории. Чтобы исследование было информативным, должен приложить усилия и сам больной. Так, необходимо строго придерживаться всех рекомендаций доктора и тщательно соблюдать правила подготовки к сбору материала. Очень важно не допустить загрязнения биологических образцов, иначе результаты обследования будут искажены.

Подготовка к анализу ПЦР

Подготовка к процедуре не связана особыми сложностями. Достаточно запомнить несколько правил:

– Кровь на анализ ПЦР сдается натощак. Кровь берут из вены обычно с утра стерильной иголкой в специальный контейнер.

– В течение суток до забора материала показано половое воздержание при взятие мазка ПЦР на ИППП.

– Для анализа мочи на ПЦР берется первая порция, емкость должна быть стерильной.

Как берут анализ ПЦР у мужчин и женщин

Анализ ПЦР берут у мужчин и женщин в прививочном кабинете, это кровь из вены, слюну, мазки из глотки, миндалин, смывы из носоглотки и т.д. Метод забора не отличается.

ПЦР на ИППП сдают в женской консультации при гинекологическом осмотре у женщин, это мазки из влагалища, шейки матки, уретры. У мужчин во время посещения андролога или венеролога, это мазок из уретры.

Схемы забора материала на ПЦР

Схема забора материала на ПЦР из носа

Схема забора материала на ПЦР из носа

Схема забора материала на ПЦР с миндалин

Схема забора материала на ПЦР с миндалин

Схема забора материала на ПЦР со слизистой глаз

Схема забора материала на ПЦР со слизистой глаз

Схема забора материала на ПЦР со слизистой щеки

Схема забора материала на ПЦР со слизистой щеки

Читайте также:  Обработка пациента при выявлении педикулеза

Схема забора материала на ПЦР у женщин

Схема забора материала на ПЦР у женщин

Схема забора материала на ПЦР у мужчин

Схема забора материала на ПЦР у мужчин

Сколько по времени делается ПЦР

Пациентам не приходится долго ждать результатов ПЦР-обследования. На всю процедуру анализа обычно уходит от нескольких часов (ПЦР в реальном времени) до 2-10 суток. Как правило, результаты анализа на руки пациент получает через 2-5 дней, максимально до 10 дней, это зависит от вида анализа. Дольше всего делается ПЦР-диагностика крови на ВИЧ и гепатиты, а меньше всего мазки и соскобы – 2-3 дня.

Расшифровка ПЦР анализа

Отрицательный результат говорит о том, что на данный момент в биологическом материале не выявляются следы возбудителей инфекции. То есть инфекция, по поводу которой проводилось обследование, отсутствует.

Положительный результат говорит об обнаружении следов возбудителя в биологических образцах. Это значит, что в данное время в организме человека присутствует инфекция.

Возможны случаи, когда ПЦР дает положительный результат, но активного инфекционного процесса не наблюдается. Речь идет о явлении, которое называют «здоровым носительством». Лечение таким пациентом не требуется, но они должны находиться под постоянным динамическим наблюдением. Такие ситуации характерны для вирусных инфекций: вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), гинитальный герпес, цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), вирус папилломы человека(ВПЧ), при которых для исследования берутся образцы из местных очагов (соскоб уретры, цервикального канала, слюна). При этом нельзя забывать, что здоровый носитель может передать инфекцию другим людям. Кроме того, не исключена активация инфекционного процесса. В случаях, когда ПЦР дает положительный результат при исследовании крови, это уже нельзя считать носительством. Таким пациентам необходимо специфическое лечение заболевания вызванного обнаруженным возбудителем.

Количественные показатели не имеют общих градаций. Их оценивает врач индивидуально для каждой конкретной инфекции. Количественный результат дает возможность определить насколько активна инфекция и выявить стадию процесса.

Расшифровка ПЦР анализа

Достоверность ПЦР-метода

Для оценки эффективности методики есть три критерия:

– Точность – выявление инфекции (или ее отсутствия) с высокой степенью вероятности.

– Специфичность – точность определения конкретного возбудителя.

– Чувствительность – возможность идентификации возбудителя даже при малом количестве генетического материала в биологических образцах.

При использовании метода ПЦР получение ложноположительных результатов практически невозможно (то есть, если возбудитель отсутствует, то положительной проба не будет).

Ложноотрицательный результат возможен, но такое происходит довольно редко. Подобные ситуации возникают, если инфекция на момент исследования неактивна. К примеру, хроническая инфекция вне активности или же латентная инфекция.

История открытия

Изобрел способ полимеразной цепной реакции (ПЦР) американский ученый Кэри Мюллис в 1983 г. Изначально запатентован метод диагностики компанией “Цетус Корпорейшн”, в которой и работал его создатель. Но в 1992 г. все права и патенты были проданы компании “Хоффман-Ля Рош”. После чего оказалось, что параллельно похожие исследования проводились и были зафиксированы другими американскими биологами, такими как Элис Чен, Дэвид Эдгар, Джон Трел. В 1980 г. занимались данной проблемой и советские ученые А. Слюсаренко, А. Каледин и С. Городецкий. Поэтому определить единственного правообладателя оказалось невозможным. Многие выдающиеся биохимики внесли определенный вклад в разработку методики полимеразной церной реакции и запатентовали свои нововведения. На данный момент анализ методом ПЦР проводят повсеместно в специально оборудованных лабораториях.

Сущность метода ПЦР-диагностики

Анализ ПЦР: что это такое и как он работает? Сущность метода заключается в том, чтобы с помощью специального фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях увеличить в объеме определенную микробную среду. Для этого многократно преумножают имеющийся ДНК-материал. Таким образом, при наличии патогенного микроорганизма в образце его количество будет увеличено за счет биохимических лабораторных манипуляций, и бактерию не составит труда обнаружить в микроскоп.

Анализ ПЦР - что это такое?

Как проводится исследование материала?

Для проведения анализа требуется:

  • ДНК-матрица;
  • праймеры, соединяющие концы фрагмента материала;
  • термоустойчивый фермент ДНК-полимеразы;
  • химические вещества, обеспечивающие правильную работу ферментов;
  • буферный раствор, необходимый для создания соответствующих условий для роста и развития ДНК-материала.

    Анализ ПЦР 12

Для выполнения ПЦР выполняют 25-30 повторов, состоящих из трех стадий: денатурации, отжига и элонгации.

Для анализа полимезарной цепной реакции используют специальный прибор – амплификатор. Современное оборудование позволяет устанавливать необходимую программу нагревания и охлаждения пробирок для устранения ошибок во время проведения диагностики.

Где применяют диагностику?

Метод полимезарной цепной реакции используют в различных областях медицины:

  • криминалисты с его помощью идентифицируют генетический материал, например волосы, слюну или кровь;
  • анализ крови ПЦР помогает при генотипировании, например для обнаружения индивидуальной генетически заложенной реакции на определенный лекарственный препарат;
  • с помощью такого метода устанавливают наличие родственных связей между людьми;
  • самым востребованным ПЦР-метод стал в медицинской диагностике для определения различных инфекционных заболеваний.

Какие инфекции выявляет ПЦР?

Итак, медицина давно и успешно использует анализ ПЦР. Что это такое, мы уже узнали. А каких возбудителей можно обнаружить с его помощью? Методом ПЦР диагностируются следующие инфекционные заболевания:

  • гепатиты А, В, С;
  • уреаплазмоз;
  • кандидоз;
  • хламидиоз;
  • микоплазмоз;
  • гарднереллез;
  • инфекционный мононуклеоз;
  • трихомониаз;
  • папилломавирусная инфекция;
  • туберкулез;
  • герпесная инфекция 1-го и 2-го типов;
  • хеликобактериоз;
  • цитомегаловирус;
  • дифтерия;
  • сальмонеллез;
  • ВИЧ-инфекция.

    Анализ ПЦР на ВИЧ

Также методы ПЦР используются в диагностике онкозаболеваний.

Преимущества метода

Диагностика ПЦР обладает рядом преимуществ:

  1. Высокая чувствительность. Даже при наличии всего нескольких молекул ДНК микроорганизма анализ ПЦР определяет наличие инфекции. Поможет метод при хронических и латентно протекающих заболеваниях. Часто в таких случаях микроорганизм является некультивируемым иными способами.
  2. Для исследования подходит любой материал, например слюна, кровь, половые выделения, волосы, клетки эпителия. Наиболее распространенным является анализ крови и урогенитального мазка на ПЦР.

    ПЦР: сдать анализ

  3. Не требуется длительного выращивания культур. Автоматизированный процесс проведения диагностики позволяет получить результаты исследования спустя 4-5 часов.
  4. Метод является практически стопроцентно достоверным. Зафиксированы лишь единичные случаи ложноотрицательного результата.
  5. Возможность определить несколько видов возбудителей из одной пробы материала. Это не только ускоряет процесс диагностики заболевания, но и существенно снижает материальные затраты. Часто врач назначает комплексный анализ ПЦР. Цена обследования, состоящего из определения шести возбудителей, составляет около 1500 рублей.

Рекомендации по подготовке к анализу

Чтобы результаты были достоверными при проведении исследования ПЦР, сдать анализ нужно, соблюдая рекомендации по предварительной подготовке к диагностике:

  1. Перед сдачей слюны следует воздержаться от приема пищи и лекарств за 4 часа до забора материала. Непосредственно перед процедурой прополощите рот кипяченой водой.
  2. Вышеуказанными правилами нужно руководствоваться и при взятии образца с внутренней поверхности щеки. После полоскания рекомендуют провести легкий массаж кожи для выделения секрета железы.
  3. Мочу обычно собирают в домашних условиях. Для этого нужно провести тщательный туалет половых органов. В стерильный пластиковый контейнер необходимо собрать 50-60 мл мочи. Для обеспечения чистоты материала рекомендуется женщинам вставить тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть кожную складку. Нельзя сдавать материал в период менструальных выделений.
  4. Для сдачи спермы нужно воздержаться от полового акта в течение 3 дней до забора материала. Также врачи советуют отказаться от посещения сауны и принятия горячей ванны, употребления алкоголя и острой пищи. За 3 часа до анализа нужно воздержаться от мочеиспускания.
  5. Для сдачи урогенитального мазка, например если проводится анализ на хламидии ПЦР, как женщинам, так и мужчинам рекомендуется половой покой в течение 3 дней. За 2 недели до анализа нельзя принимать антибактериальные препараты. За неделю нужно прекратить использование интимных гелей, мазей, влагалищных свечей, спринцевание. За 3 часа до исследования нужно воздержаться от мочеиспускания. Во время менструаций забор материала не проводится, лишь спустя 3 дня после прекращения кровяных выделений можно взять урогенитальный мазок.

ПЦР во время беременности

В период ожидания малыша многие инфекционные заболевания, передающиеся половым путем, являются крайне опасными для нормального развития плода. ЗППП могут спровоцировать внутриутробную задержку развития, выкидыш или преждевременные роды, врожденные пороки ребенка. Поэтому крайне важно пройти на ранних сроках беременности обследование методом ПЦР. Сдать анализ необходимо при постановке на учет – до 12 недель.

Анализ на хламидии ПЦР

Забор материала происходит из канала шейки матки с помощью специальной щеточки. Процедура безболезненная и не представляет опасности для малыша. Обычно во время беременности проводят анализ на хламидии ПЦР-методом, а также на уреаплазмоз, микоплазмоз, цитомегаловирус, герпес, папилломавирус. Такой комплекс обследования называют ПЦР-6.

ПЦР для диагностики ВИЧ

В связи с тем, что метод полимеразной цепной реакции очень чувствителен к изменениям в организме и условиям проведения диагностики, многие факторы могут повлиять на результат. Поэтому анализ ПЦР на ВИЧ-инфекцию не является достоверным методом, его эффективность – 96–98 %. В остальных 2-4 % случаев тест дает ложноположительные результаты.

Но в некоторых ситуациях без ПЦР-диагностики ВИЧ не обойтись. Обычно ее проводят людям с ложноотрицательным результатом ИФА. Такие показатели говорят о том, что у человека еще не выработались антитела к вирусу и их невозможно выявить без многократного увеличения количества. Именно этого можно достичь, проведя анализ крови ПЦР-методом.

Также необходима такая диагностика детям первого года жизни, рожденным от ВИЧ-позитивной матери. Метод является единственным способом достоверного определения статуса ребенка.

ПЦР для диагностики гепатитов

Метод полимеразной цепной реакции позволяет обнаружить ДНК вируса гепатитов А, В, С задолго до образования антител к инфекции или появления симптомов болезни. Особенно эффективным является анализ ПЦР на гепатит С, так как в 85 % случаев такое заболевание протекает бессимптомно и без своевременного лечения переходит в хроническую стадию.

Анализ крови ПЦР

Своевременное обнаружение возбудителя поможет избежать осложнений и длительного лечения.

Комплексное обследование ПЦР

Комплексный анализ ПЦР: что это такое? Это обследование методом полимезарной цепной реакции, которое включает в себя определение одновременно нескольких видов инфекций: микоплазмы гениталиум, микоплазмы хоминис, гарднереллы вагиналис, кандиды, трихомонады, цитомегаловируса, уреаплазмы уреалитикум, герпеса 1-го и 2-го типов, гонореи, папилломавируса. Цена такой диагностики колеблется от 2000 до 3500 руб. в зависимости от клиники, используемых материалов и оборудования, а также от вида анализа: качественного или количественного. Какой необходим в вашем случае – решит врач. В одних случаях достаточно лишь просто определить наличие возбудителя, в других, например при ВИЧ-инфекции, важную роль играет количественный титр. При диагностике всех вышеперечисленных возбудителей обследование называют «анализ ПЦР-12».

Расшифровка результатов анализа

Расшифровка анализа ПЦР не представляет сложности. Есть лишь 2 шкалы показателя – «положительный результат» и «отрицательный результат». При обнаружении возбудителя врачи могут с 99%-й уверенностью подтвердить наличие заболевания и приступить к лечению пациента. При количественном методе определения инфекции в соответствующей графе будет указан числовой показатель обнаруженных бактерий. Только врач может определить степень заболевания и назначить необходимое лечение.

Где сдать ПЦР анализ?

В некоторых случаях, например при определении ВИЧ-инфекции методом ПЦР, при отрицательном результате возникает необходимость проведения дополнительных обследований для подтверждения полученных показателей.

Читайте также:  Дибазол для повышения иммунитета, лечения неврологических и других заболеваний

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

  1. Урогинекология. Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
  2. Неонатология. Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
  3. Служба крови. Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
  4. Клиника инфекционных заболеваний. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
  5. Фтизиатрия и пульмонология. ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

На заметку
ПЦР-диагностика используется в криминалистике для определения принадлежности найденного на месте преступления биоматериала, а также в экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

  • Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
  • Высокая специфичность метода. Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
  • Высокая чувствительность. При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
  • Универсальность. Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
  • Скорость получения результатов. Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
  • Диагностика латентных инфекций. ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма. При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции. Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов. Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

  1. Забор биоматериала. Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
    • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
    • Моча. Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
    • Мокрота. Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
    • Кровь, сыворотка, плазма. С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
    • Биологические жидкости. К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
    • Биоптаты, т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм3.
  2. Хранение и транспортировка биоматериала. Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
  3. Выделение ДНК из образца. Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
  4. Проведение ПЦР. Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные, включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные, не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
  5. Регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
  6. Интерпретация результатов исследования. Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.
Источники

  • https://lediveka.ru/zdorove/analiz-pcr.html
  • https://MyAnaliz.ru/blood/analiz-krovi-na-ptsr
  • http://genitalhealth.ru/138/Analiz-PTSR/
  • http://fb.ru/article/172566/analiz-ptsr-chto-eto-takoe-kak-pravilno-sdavat-analiz-ptsr
  • https://www.kp.ru/guide/diagnostika-metodom-ptsr.html

[свернуть]
Помогла статья? Оцените её
1 Звезда2 Звезды3 Звезды4 Звезды5 Звезд
Загрузка...